บทความประจำปี 2549

การตรวจหาเชื้อไมโคพลาสมาที่ปนเปื้อนในเซลล์เพาะเลี้ยงทั่วไป

เชื้อไมโคพลาสมา (Mycoplasmas) เป็นเชื้อที่มีการปนเปื้อนในเซลล์เพาะเลี้ยงที่พบได้บ่อย โดยไม่มีการควบคุมคุณภาพของเซลล์ เพื่อให้ได้เซลล์ที่มีมาตรฐานสากลในการตรวจหาเชื้อสามารถตรวจได้โดยตรงด้วยการย้อม DNA ด้วยสี fluorescent ร่วมกับการเพาะเลี้ยงในอาหารเหลว  และอาหารแข็ง  ผลการทดลองพบว่าเชื้อ Mycoplasma pneumoniae มาตรฐาน สามารถเพาะเลี้ยงได้ดีในอาหารเหลวและอาหารแข็งที่เตรียมขึ้นในห้องปฏิบัติการในสภาวะที่มีออกซิเจน และเมื่อนำเซลล์เพาะเลี้ยงในห้องปฏิบัติการมาตรวจหาเชื้อ Mycoplasmas ในเบื้องต้น ไม่พบการปนเปื้อนของเชื้อในเซลล์ที่ทดสอบ โดยเทียบผลกับ positive และ negative control ที่ได้จาก test kit อย่างไรก็ตามจะต้องตรวจหาสภาวะที่เหมาะสมต่อการเพาะเลี้ยงเชื้อ Mycoplasmas ในเซลล์ เพื่อใช้เป็น positive control ในสภาวะที่เลียนแบบการติดเชื้อตามธรรมชาติ โดยนำเชื้อมาตรฐานอีก 2 ชนิดมาทดสอบร่วมด้วย คือ Mycoplasma arginini และ Acholeplasma laidlawii ซึ่งสั่งซื้อจาก ATCC เพื่อเป็นการยืนยันว่าเซลล์ที่เลี้ยงในห้องปฏิบัติการไม่มีการปนเปื้อนเชื้อ Mycoplasmas จริง หรืออาจยืนยันโดยวิธี PCR งานวิจัยนี้เป็นงานวิจัยแรกในประเทศเพื่อพัฒนาการตรวจสอบการปนเปื้อนของเชื้อ Mycoplasmas ในเซลล์เพาะเลี้ยงทั่วไป ระยะเวลา  2 ปี โดยเริ่มปี 2548- 2549

การตรวจหาการปนเปื้อนของเชื้อไมโคพลาสมาในเซลล์เพาะเลี้ยง

การปนเปื้อนของเชื้อมัยโคพลาสมา (mycoplasma) ในเซลล์เพาะเลี้ยง เป็นหนึ่งของปัญหาใหญ่ในเทคโนโลยีของการเพาะเลี้ยงเซลล์ ดังนั้นการ ป้องกันโดยการเฝ้าระวังอย่างต่อเนื่องจึงต้องใช้วิธีการทดสอบที่เหมาะสม เพียงพอ ปัจจุบันมี 2 วิธีหลักสำหรับยืนยันการตรวจหาเชื้อ mycoplasma ในเซลล์เพาะเลี้ยง คือ วิธีทางอ้อมโดยการย้อม DNA ด้วยสารเรืองแสง และการเพิ่มจำนวน DNA โดยวิธี PCR ซึ่งได้ถูกนำมาเปรียบเทียบกับ วิธีมาตรฐานของการเพาะเลี้ยงเชื้อในอาหารแข็งและอาหารเหลว ผลการ ศึกษาพบว่าอาหารแข็งและอาหารเหลวที่ใช้เตรียมขึ้นในห้องปฏิบัติการ สามารถส่งเสริมการเพิ่มจำนวนของเชื้อ mycoplasma ทั้ง 3 สายพันธุ์ที่ใช้ ในการศึกษานี้ คือ Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma arginini และ Acholaplasma laidlawii โดยพบว่าเซลล์เพาะเลี้ยงชนิดเกาะพื้นผิว เพิ่มจำนวนได้อย่างต่อเนื่องทั้ง 3 ชนิด ให้ผลบวกและเซลล์แขวนลอยทั้ง 2 ชนิด ให้ผลลบโดยการเพาะเลี้ยงเชื้อในอาหารแข็งภายใน 21 วันและ โดย PCR สำหรับ DNA ที่ให้ผลบวกจากเซลล์เพาะเลี้ยงชนิดเกาะพื้นผิว เพิ่มจำนวนได้อย่างต่อเนื่องจะแสดงแถบ DNA ที่เป็น internal control ที่ 191 bp ร่วมกับแถบ DNA ของเชื้อ mycoplasma ที่ 265-278 bp ในทาง กลับกันการตรวจ DNA ทางอ้อมด้วยการย้อมสีด้วยสารเรืองแสง Hoechst 33258 ไม่สามารถแยกความแตกต่างโดยให้ผลที่เสมอเหมือนกับการ เพาะเลี้ยงในอาหารแข็ง เพื่อยืนยันว่าวิธี PCR มีความจำเพาะต่อการตรวจ หาเชื้อ mycoplasma การกำจัดเชื้อ mycoplasma ออกจากเซลล์ได้ถูกนำมา ใช้และพบว่าให้ผลลบของ DNA ที่ไม่มีการปนเปื้อนเชื้อ mycoplasma หลังการกำจัดเชื้อ จึงสรุปได้ว่าการเพิ่มจำนวน DNA โดยวิธี PCR เป็นวิธี ที่เหมาะสมสำหรับคัดกรองในงานประจำและสามารถนำมาใช้ร่วมกับ การเพาะเลี้ยงเชื้อในอาหารสำหรับการตรวจหาการปนเปื้อนของเชื้อ mycoplasma ในเซลล์เพาะเลี้ยง

การปนเปื้อนของเชื้อมัยโคพลาสมา (mycoplasma) ในเซลล์เพาะเลี้ยง

เป็นหนึ่งของปัญหาใหญ่ในเทคโนโลยีของการเพาะเลี้ยงเซลล์ ดังนั้นการป้องกันโดยการเฝ้าระวังอย่างต่อเนื่องจึงต้องใช้วิธีการทดสอบที่เหมาะสมเพียงพอ ปัจจุบันมี 2 วิธีหลักสำหรับยืนยันการตรวจหาเชื้อ mycoplasma ในเซลล์เพาะเลี้ยง คือ วิธีทางอ้อมโดยการย้อม DNA ด้วยสารเรืองแสงและการเพิ่มจำนวน DNA โดยวิธี PCR ซึ่งได้ถูกนำมาเปรียบเทียบกับ

วิธีมาตรฐานของการเพาะเลี้ยงเชื้อในอาหารแข็งและอาหารเหลว ผลการศึกษาพบว่าอาหารแข็งและอาหารเหลวที่ใช้เตรียมขึ้นในห้องปฏิบัติการสามารถส่งเสริมการเพิ่มจำนวนของเชื้อ mycoplasma  ทั้ง 3 สายพันธุ์ที่ใช้ในการศึกษานี้ คือ Mycoplasma  pneumoniae, Mycoplasma arginini และ  Acholaplasma laidlawii  โดยพบว่าเซลล์เพาะเลี้ยงชนิดเกาะพื้นผิวเพิ่มจำนวนได้อย่างต่อเนื่องทั้ง 3 ชนิด ให้ผลบวกและเซลล์แขวนลอยทั้ง 2 ชนิด ให้ผลลบโดยการเพาะเลี้ยงเชื้อในอาหารแข็งภายใน 21 วันและโดย PCR  สำหรับ DNA ที่ให้ผลบวกจากเซลล์เพาะเลี้ยงชนิดเกาะพื้นผิวเพิ่มจำนวนได้อย่างต่อเนื่องจะแสดงแถบ DNA ที่เป็น internal control ที่ 191 bp ร่วมกับแถบ DNA ของเชื้อ mycoplasma ที่ 265-278 bp ในทางกลับกันการตรวจ DNA ทางอ้อมด้วยการย้อมสีด้วยสารเรืองแสง Hoechst 33258 ไม่สามารถแยกความแตกต่างโดยให้ผลที่เสมอเหมือนกับการเพาะเลี้ยงในอาหารแข็ง  เพื่อยืนยันว่าวิธี PCR มีความจำเพาะต่อการตรวจหาเชื้อ mycoplasma การกำจัดเชื้อ mycoplasma ออกจากเซลล์ได้ถูกนำมาใช้และพบว่าให้ผลลบของ DNA ที่ไม่มีการปนเปื้อนเชื้อ mycoplasma หลังการกำจัดเชื้อ จึงสรุปได้ว่าการเพิ่มจำนวน DNA โดยวิธี PCR เป็นวิธีที่เหมาะสมสำหรับคัดกรองในงานประจำและสามารถนำมาใช้ร่วมกับการเพาะเลี้ยงเชื้อในอาหารสำหรับการตรวจหาการปนเปื้อนของเชื้อ mycoplasma ในเซลล์เพาะเลี้ยง