Annual Article 2005

การตรวจหาเชื้อไมโคพลาสมาที่ปนเปื้อนในเซลล์เพาะเลี้ยงทั่วไป

เชื้อไมโคพลาสมา (Mycoplasmas) เป็นเชื้อที่มีการปนเปื้อนในเซลล์เพาะเลี้ยงที่พบได้บ่อย โดยไม่มีการควบคุมคุณภาพของเซลล์ เพื่อให้ได้เซลล์ที่มีมาตรฐานสากลในการตรวจหาเชื้อสามารถตรวจได้โดยตรงด้วยการย้อม DNA ด้วยสี fluorescent ร่วมกับการเพาะเลี้ยงในอาหารเหลว  และอาหารแข็ง  ผลการทดลองพบว่าเชื้อ Mycoplasma pneumoniae มาตรฐาน สามารถเพาะเลี้ยงได้ดีในอาหารเหลวและอาหารแข็งที่เตรียมขึ้นในห้องปฏิบัติการในสภาวะที่มีออกซิเจน และเมื่อนำเซลล์เพาะเลี้ยงในห้องปฏิบัติการมาตรวจหาเชื้อ Mycoplasmas ในเบื้องต้น ไม่พบการปนเปื้อนของเชื้อในเซลล์ที่ทดสอบ โดยเทียบผลกับ positive และ negative control ที่ได้จาก test kit อย่างไรก็ตามจะต้องตรวจหาสภาวะที่เหมาะสมต่อการเพาะเลี้ยงเชื้อ Mycoplasmas ในเซลล์ เพื่อใช้เป็น positive control ในสภาวะที่เลียนแบบการติดเชื้อตามธรรมชาติ โดยนำเชื้อมาตรฐานอีก 2 ชนิดมาทดสอบร่วมด้วย คือ Mycoplasma arginini และ Acholeplasma laidlawii ซึ่งสั่งซื้อจาก ATCC เพื่อเป็นการยืนยันว่าเซลล์ที่เลี้ยงในห้องปฏิบัติการไม่มีการปนเปื้อนเชื้อ Mycoplasmas จริง หรืออาจยืนยันโดยวิธี PCR งานวิจัยนี้เป็นงานวิจัยแรกในประเทศเพื่อพัฒนาการตรวจสอบการปนเปื้อนของเชื้อ Mycoplasmas ในเซลล์เพาะเลี้ยงทั่วไป ระยะเวลา  2 ปี โดยเริ่มปี 2548- 2549

ปัจจัยที่มีผลต่อเซลล์เพาะเลี้ยงที่ใช้ในการตรวจสอบความแรงของวัคซีนไวรัส

การศึกษาถึงปัจจัยซึ่งมีผลต่อการตรวจสอบความแรงของวัคซีนไวรัสหัด หัดเยอรมัน และโปลิโอได้ถูกนำมาศึกษา โดยใช้เซลล์เพาะเลี้ยง Vero ซึ่งได้มาจาก เซลล์มะเร็งของไตลิง ส่วน RK-13 ได้มาจากเซลล์มะเร็งของไตกระต่าย และ Hep-2 ได้มาจากเซลล์มะเร็งจากกล่องเสียงของคนตามลำดับ ผลการศึกษาพบว่าการเลี้ยงเซลล์ Vero RK-13 และ Hep-2 ในสภาวะ ที่มีก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ 5% มีปริมาณเซลล์สูง 2-3 เท่า เมื่อเทียบกับใน สภาวะที่ไม่มีก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ ส่วนผลของปริมาณซีรัมต่อเซลล์พบว่า การเลี้ยงเซลล์ RK-13 และ Hep-2 ที่ปริมาณซีรัม 10% ปริมาณเซลล์ที่ได้ ไม่แตกต่างจากการใช้ซีรัม 8% เมื่อเลี้ยงนาน 4 วัน ส่วนเซลล์ Vero ที่ ซีรัม 10% ปริมาณเซลล์ที่ได้แตกต่างจากการใช้ซีรัม 8% อย่างมีนัยสำคัญ เมื่อศึกษาระยะเวลาและจำนวนเซลล์ที่เก็บไว้ที่ -70oC ความเข้มข้นต่างๆ กันต่อการอยู่รอดของเซลล์ RK-13 ในช่วงเวลา 1 ปี พบว่าเซลล์ RK-13 มีชีวิตรอดประมาณ 98-85% โดยความเข้มข้นของเซลล์ที่เพิ่มขึ้นมีความ สัมพันธ์กับการเพิ่มจำนวนเซลล์ในช่วงเวลา 7 วัน แต่ไม่สัมพันธ์กับ การตายของเซลล์ นอกจากนี้การวิจัยนี้ได้ใช้วัคซีนอ้างอิงมาตรฐานที่ เตรียมขึ้นในห้องปฏิบัติการเป็นตัวชี้วัดความไวของเซลล์ทั้ง 3 ในช่วง 20 passages ผลการทดลองพบว่าเซลล์ยังคงความไวต่อวัคซีนไวรัสที่ ทดสอบ สรุปคือเซลล์ Vero, RK-13 และ Hep-2 มีคุณภาพเหมาะสมต่อการ นำมาใช้ตรวจสอบความแรงของวัคซีนไวรัสที่ทดสอบ

การศึกษาถึงปัจจัยซึ่งมีผลต่อการตรวจสอบความแรงของวัคซีนไวรัสหัด หัดเยอรมันและโปลิโอได้ถูกนำมาศึกษา โดยใช้เซลล์เพาะเลี้ยง Vero ซึ่งได้มาจากเซลล์มะเร็งของไตลิง ส่วน RK-13 ได้มาจากเซลล์มะเร็งของไตกระต่ายและ Hep-2 ได้มาจากเซลล์มะเร็งจากกล่องเสียงของคนตามลำดับ  

ผลการศึกษาพบว่าการเลี้ยงเซลล์ Vero  RK-13 และ Hep-2 ในสภาวะที่มีก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ 5% มีปริมาณเซลล์สูง 2-3 เท่า เมื่อเทียบกับในสภาวะที่ไม่มีก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ ส่วนผลของปริมาณซีรัมต่อเซลล์พบว่าการเลี้ยงเซลล์ RK-13 และ Hep-2 ที่ปริมาณซีรัม 10% ปริมาณเซลล์ที่ได้ไม่แตกต่างจากการใช้ซีรัม 8% เมื่อเลี้ยงนาน 4 วัน ส่วนเซลล์ Vero ที่ ซีรัม 10% ปริมาณเซลล์ที่ได้แตกต่างจากการใช้ซีรัม 8% อย่างมีนัยสำคัญ เมื่อศึกษาระยะเวลาและจำนวนเซลล์ที่เก็บไว้ที่ -70oC ความเข้มข้นต่างๆกันต่อการอยู่รอดของเซลล์ RK-13 ในช่วงเวลา 1 ปี พบว่าเซลล์ RK-13 มีชีวิตรอดประมาณ 98-85% โดยความเข้มข้นของเซลล์ที่เพิ่มขึ้นมีความสัมพันธ์กับการเพิ่มจำนวนเซลล์ในช่วงเวลา 7 วัน แต่ไม่สัมพันธ์กับการตายของเซลล์  นอกจากนี้การวิจัยนี้ได้ใช้วัคซีนอ้างอิงมาตรฐานที่เตรียมขึ้นในห้องปฏิบัติการเป็นตัวชี้วัดความไวของเซลล์ทั้ง 3 ในช่วง 20 passages ผลการทดลองพบว่าเซลล์ยังคงความไวต่อวัคซีนไวรัสที่ทดสอบ สรุปคือเซลล์ Vero, RK-13 และ Hep-2 มีคุณภาพเหมาะสมต่อการนำมาใช้ตรวจสอบความแรงของวัคซีนไวรัสที่ทดสอบ