Annual Article 2004

การเตรียมเชื้อไวรัสพิษสุนัขบ้ามาตรฐานในเซลล์เพาะเลี้ยง

การเตรียมเชื้อพิษสุนัขบ้ามาตรฐาน (CVS) เพื่อนำไปใช้ในการตรวจประสิทธิภาพของวัคซีนป้องกันโรคพิษสุนัขบ้าของกองชีววัตถุ จะเตรียม CVS ในสมองหนูขาว เชื้อที่เตรียมได้สามารถนำมาเจือจางได้มาก และสามารถเตรียมเชื้อใหม่ได้ใกล้เคียงของเดิม แต่เชื้อที่ได้มีการปนเปื้อนของเนื้อสมอง มีความยุ่งยากในการควบคุมคุณภาพของหนูขาวเล็กที่ใช้ในการเตรียม ใช้สัตว์ทดลองจำนวนมากในการเตรียม และมีค่าใช้จ่ายสูง จึงทำการศึกษาโดยเตรียม CVS ในเซลล์เพาะเลี้ยงเนื่องจากสามารถเตรียม CVS ในเซลล์เพาะเลี้ยงได้จำนวนมาก ปนเปื้อนน้อยเนื่องจากสามารถควบคุมสภาพแวดล้อมได้ง่าย แต่มีข้อเสียคือ CVS ใหม่ที่ได้จะมี Virulence ลดลงนอกจากนี้ค่าใช้จ่ายสูง โดยทำการศึกษาการเตรียม CVS ในเซลล์เพาะเลี้ยง 3 ชนิดคือ MNA,BHK-21/C13 และ VERO JCRB คัดเลือกชนิดที่เหมาะสมเพียงชนิดเดียว และนำเปรียบเทียบค่าระดับความเจือจางของ CVS ที่สามารถทำให้สัตว์ทดลองตายร้อยละ 50 (Lethal Dose 50 % , LD50) กับเตรียม CVS ในสมองหนูขาว ซึ่งถ้าพบว่าค่าเฉลี่ย LD50 ของการเตรียม CVS ทั้ง 2 วิธีไม่แตกต่างกันก็จะนำการตรียม CVS เซลล์เพาะเลี้ยงมาใช้แทนการเตรียม CVS ในสมองหนูขาวต่อไป เพื่อลดการปนเปื้อนของเชื้อ และลดปริมาณการใช้สัตว์ทดลอง ขณะนี้ทำการเพิ่มจำนวนในเซลล์ทั้ง 3 ชนิดๆละ 6 passage เรียบร้อยแล้ว ทำการศึกษาคัดเลือกเซลล์เพาะเลี้ยงโดยวิธี Immunofluorescent พบว่าเซลล์ที่เหมาะสมคือ เซลล์ MNA   และกำลังเตรียมการทดสอบความสามารถทำให้เกิดโรค (virulence) ทั้งในร่างกายสัตว์ทดลอง (in vivo) และในหลอดทดลอง (in vitro) ก่อนที่จะนำมามาใช้เปรียบเทียบค่า LD50 กับ CVS ที่เตรียมในสมองหนูขาวต่อไป

การพัฒนาวิธีการตรวจสอบคุณภาพวัคซีนไข้เลือดออก

การวิจัยนี้มีจุดประสงค์เพื่อพัฒนาวิธีการตรวจสอบคุณภาพวัคซีนไข้เลือดออก    ซึ่งเป็นโรคติดเชื้อที่เป็นปัญหาสาธารณสุขในประเทศไทย  โดยมียุงเป็นพาหะนำโรค  ดังนั้นการป้องกันและควบคุมโรคในปัจจุบัน ได้แก่ การป้องกันไม่ให้ยุงกัด กำจัดยุงและแหล่งเพาะพันธุ์ยุง  ซึ่งวิธีการดังกล่าวไม่สามารถดำเนินการได้อย่างมีประสิทธิผลเต็มที่   จึงได้มีการพัฒนาวัคซีนเพื่อนำมาใช้ในการป้องกัน   กองชีววัตถุในฐานะผู้ควบคุมคุณภาพวัคซีนในประเทศมีความจำเป็นต้องพัฒนาวิธีการตรวจสอบคุณภาพวัคซีนไข้เลือดออก   เพื่อรับรองวัคซีนที่จะนำมาใช้ในอนาคต  โดยวิธีการศึกษาได้เพิ่มจำนวนไวรัสทั้ง vaccine strain และ wild type ในเซลล์เพาะเลี้ยงหรือในสมองหนูและพัฒนาวิธีตรวจหาปริมาณไวรัสโดยการทำ  virus titration นอกจากนั้นยังศึกษาลักษณะความแตกต่างของ vaccine strain และ wild type  เช่น ศึกษาลักษณะขนาดของ plaques ศึกษาความไวต่ออุณหภูมิสูงเป็นต้น 

ผลการศึกษาได้พัฒนาวิธีการตรวจหาปริมาณไวรัสทั้ง 4 ทัยป์โดยวิธี  plaques titration ในเซลล์เพาะเลี้ยง LLC-MK2 และพบว่าไวรัสทัยป์ 1 และ 4 ขนาดของ plaques ของทั้ง vaccine strain   และ wild type ไม่สามารถวัดขนาดความแตกต่างได้  รวมทั้งเมื่อศึกษาความไวต่ออุณหภูมิสูง ทั้ง wild type และ  vaccine strain  มีความไวต่ออุณหภูมิสูง  นั่นคือ ปริมาณไวรัสลดลงเมื่อเทียบกับอุณหภูมิปกติ  สำหรับไวรัสทัยป์ 2, 3  เนื่องจากค่า  titer ที่ได้ต่ำ  จึงจำเป็นต้องนำมาเพิ่มจำนวนในเซลล์หรือสมองหนูเพื่อทำการศึกษาต่อไป อย่างไรก็ตามวิธีการศึกษานี้จะเป็นประโยชน์ต่อการนำมาใช้เป็นข้อมูลในการตรวจสอบคุณภาพของวัคซีนป้องกันโรคไข้เลือดออกในประเทศต่อไป

การศึกษาความเป็นพิษของ Pertussis toxin ในวัคซีนป้องกันโรคไอกรน

 ปัจจุบันการทดสอบค่าความเป็นพิษของ pertussis toxin เป็นการทดสอบ

ในเชิงคุณภาพว่ามีความเป็นพิษอยู่หรือไม่แต่ไม่ทราบค่าที่แน่นอนว่ามีปริมาณเท่าไร โครงการนี้มีวัตถุประสงค์ที่สำคัญ คือ เพื่อศึกษาความเป็นพิษของ pertussis toxin ในวัคซีนป้องกันโรคไอกรนในเชิงปริมาณในหน่วยของ BWDU (Body weight decreasing unit), LPU (Lymphocytosis promoting unit ) และ HSU (Histamine sensitizing unit) โดยทำการศึกษาในวัคซีน DTP ที่ผลิตในประเทศและนำเข้าจากต่างประเทศ โดยการทดสอบ Toxicity test ของวัคซีนป้องกันโรคไอกรน

ประกอบด้วยการทดสอบย่อย 4 การทดสอบคือ Body weight decreasing test (BWD), Leukocytosis promoting test (LP), Early histamine-sensitizing (EHS) และ Late histamine- sensitizing (LHS) โดยการทดสอบจะใช้สัตว์ทดลองชุดเดียวกัน คือ หนูขาวเล็กสายพันธุ์ ICR ประโยชน์ที่คาดว่าจะได้รับจากโครงการนี้ คือ เป็นข้อมูลในการศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างอาการข้างเคียงหลังการได้รับวัคซีนป้องกันโรคไอกรนกับปริมาณความเป็นพิษของ Pertussis toxin และเพื่อพัฒนามาตรฐานการควบคุมคุณภาพของวัคซีนป้องกันโรคไอกรน ขณะนี้ได้ทำการทดสอบไปได้ทั้งสิ้น 45 ตัวอย่าง แยกเป็นที่ผลิตในประเทศ 35 ตัวอย่าง และนำเข้าจากต่างประเทศ 10 ตัวอย่าง จากผลการทดสอบสรุปได้ว่า วัคซีนที่ผลิตในประเทศมีค่า BWDU โดยเฉลี่ย 1172.82 unit/ml มีค่าพิสัย (Range) อยู่ที่ (-1211.47) ถึง 3541.31   ค่า LP โดยเฉลี่ย 4.55 (X103unit/ml) มีค่าพิสัย (-8.98)  ถึง 18.08 ค่า EHS โดยเฉลี่ย 2.88 unit/ml มีค่าพิสัย (-3.05) ถึง 7.60   ค่า LHS โดยเฉลี่ย 1.10 unit/ml  มีค่าพิสัย  (-3.05) ถึง  7.60   วัคซีนที่นำเข้าจากต่างประเทศ มีค่า BWDU โดยเฉลี่ย 532.59 unit/ml มีค่าพิสัย (-510.13)   ถึง 1575.31  ค่า LP  เฉลี่ย  3.17  (X103unit/ml) ค่าพิสัย (-6.09) ถึง 12.43  ค่า EHS เฉลี่ย 3.32 unit/ml  ค่าพิสัย (-13.57)   ถึง 20.22  ค่า  LHS  เฉลี่ย  0.88  unit/ml  ค่าพิสัย (-0.36)  ถึง  2.13

ความคงตัวของวัคซีนป้องกันวัณโรคที่ผลิตโดยสถานเสาวภา สภากาชาดไทย

 การให้บริการตรวจสอบคุณภาพของกลุ่มวัคซีน กองชีววัตถุที่ผ่านมาพบว่าหน่วยงานต่าง ๆ ประสบปัญหาการเก็บรักษาวัคซีนในอุณหภูมิที่ไม่เหมาะสม เนื่องจากตู้เก็บวัคซีนเสียหรือเกิดกรณีไฟฟ้าดับ ซึ่งจะส่งผลกระทบอย่างมากต่อคุณภาพความแรงของวัคซีน โดยเฉพาะวัคซีนบีซีจี ดังนั้นจึงจำเป็นต้องศึกษาความคงตัวของวัคซีนดังกล่าว เพื่อใช้ประกอบการพิจารณาประสิทธิภาพของวัคซีนและมุ่งเน้นให้ตระหนักถึงความสำคัญในกระบวนการเก็บรักษาวัคซีนในระบบ Cold  chain  การหาค่าความคงตัวของวัคซีนบีซีจี  กระทำโดยหาค่า Culturable particle count ของวัคซีนที่เก็บในสภาวะปกติ  จากนั้นนำวัคซีนดังกล่าวเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 20-25 0c นาน 1 สัปดาห์ แล้วนำกลับมาเก็บไว้ที่อุณหภูมิ  4 0c เพื่อมาหา Culturable  count ใหม่ ที่ระยะเวลาผ่านไป 1, 3, 6, 9 และ 12  เดือน ตามลำดับ   เพื่อหาเปอร์เซ็นต์การลดลงของจำนวนเชื้อที่มีชีวิต  ซึ่งจะทำให้ทราบว่าเมื่อวัคซีนบีซีจีถูกเก็บในภาวะที่ไม่เหมาะสมจะส่งผลให้วัคซีนมีแนวโน้มของการเสื่อมคุณภาพรวดเร็วมากน้อยเพียงใด ซึ่งจะเป็นประโยชน์ต่อหน่วยงานที่มีหน้าที่ในการบริหารวัคซีนบีซีจีต่อไป  ซึ่งจากการทดสอบ potency ของวัคซีน BCG ตามระยะเวลาที่กำหนดดังกล่าว โดยเปรียบเทียบอิทธิพลของอุณหภูมิที่ใช้เก็บอิทธิพลของเวลานำค่า potency  ที่ได้โดยวิเคราะห์ความแปรปรวน  2  ทาง  (2 way Analysis of variance)  พบว่าระยะเวลาในการเก็บวัคซีนมีอิทธิพลต่อการเปลี่ยนแปลงของ potency ของวัคซีนทั้ง 2 กลุ่ม  แต่การเก็บวัคซีนไว้ที่  200c นาน  1 สัปดาห์  ไม่มีอิทธิพลต่อการเปลี่ยนแปลงค่า potency และเมื่อวิเคราะห์ผลร่วมกันพบว่าการเก็บวัคซีนที่อุณหภูมิต่างกันและเวลาที่เพิ่มขึ้นไม่มีอิทธิพลร่วมกันต่อการเปลี่ยนแปลงของค่า potency  ของวัคซีน  BCG